پی سی آر، پولیمریز چین ری ایکشن ہے، جس سے مراد ڈی این اے پولیمریز کے کیٹالیسس کے تحت سسٹم میں ڈی این ٹی پی، ایم جی 2+، ایلونیشن فیکٹرز اور ایمپلیفیکیشن بڑھانے والے عوامل کا اضافہ ہے، پیرنٹ ڈی این اے کو بطور ٹیمپلیٹ اور مخصوص پرائمر کو توسیع کے نقطہ آغاز کے طور پر استعمال کرنا، ڈینیچریشن، اینیلنگ، ایکسٹینشن وغیرہ کے مراحل کے ذریعے، ان وٹرو ریپلیٹنگ بیٹی اسٹرینڈ ڈی این اے کو پیرنٹ اسٹرینڈ ٹیمپلیٹ ڈی این اے کی تکمیل کرنے کا عمل تیزی سے اور خاص طور پر وٹرو میں کسی بھی ہدف والے ڈی این اے کو بڑھا سکتا ہے۔
1. ہاٹ سٹارٹ پی سی آر
روایتی پی سی آر میں ایمپلیفیکیشن کا آغاز وقت پی سی آر مشین کو پی سی آر مشین میں نہیں ڈالنا ہے، اور پھر پروگرام کو بڑھانا شروع ہو جاتا ہے۔جب سسٹم کنفیگریشن مکمل ہو جاتا ہے تو ایمپلیفیکیشن شروع ہو جاتا ہے، جو غیر مخصوص ایمپلیفیکیشن کا سبب بن سکتا ہے، اور ہاٹ سٹارٹ PCR اس مسئلے کو حل کر سکتا ہے۔
ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر کیا ہے؟ری ایکشن سسٹم کے تیار ہونے کے بعد، ری ایکشن کے ابتدائی ہیٹنگ سٹیج یا "ہاٹ سٹارٹ" سٹیج کے دوران انزائم موڈیفائر کو اعلی درجہ حرارت (عام طور پر 90 ° C سے زیادہ) پر جاری کیا جاتا ہے، تاکہ DNA پولیمریز فعال ہو جائے۔ایکٹیویشن کا صحیح وقت اور درجہ حرارت DNA پولیمریز اور ہاٹ سٹارٹ موڈیفائر کی نوعیت پر منحصر ہے۔یہ طریقہ بنیادی طور پر ڈی این اے پولیمریز کی سرگرمی کو روکنے کے لیے ترمیم کاروں جیسے اینٹی باڈیز، افینیٹی لیگنڈز، یا کیمیائی ماڈیفائرز کا استعمال کرتا ہے۔چونکہ ڈی این اے پولیمریز کی سرگرمی کمرے کے درجہ حرارت پر روکی جاتی ہے، اس لیے ہاٹ سٹارٹ ٹیکنالوجی پی سی آر ری ایکشنز کی مخصوصیت کو قربان کیے بغیر کمرے کے درجہ حرارت پر ایک سے زیادہ پی سی آر ری ایکشن سسٹم تیار کرنے کے لیے بڑی سہولت فراہم کرتی ہے۔
2. RT-PCR
RT-PCR (ریورس ٹرانسکرپشن پی سی آر) mRNA سے cDNA میں ریورس ٹرانسکرپشن کے لیے ایک تجرباتی تکنیک ہے اور اسے ایمپلیفیکیشن کے لیے ٹیمپلیٹ کے طور پر استعمال کرتی ہے۔تجرباتی طریقہ کار یہ ہے کہ پہلے ٹشوز یا سیلز میں کل RNA نکالا جائے، Oligo (dT) کو بطور پرائمر استعمال کیا جائے، cDNA کی ترکیب کے لیے ریورس ٹرانسکرپٹیس کا استعمال کیا جائے، اور پھر ٹارگٹ جین حاصل کرنے یا جین کے اظہار کا پتہ لگانے کے لیے PCR ایمپلیفیکیشن کے لیے بطور ٹیمپلیٹ cDNA استعمال کریں۔
3. فلوروسینٹ مقداری پی سی آر
فلوروسینٹ مقداری پی سی آر (ریئل ٹائم مقداری پی سی آر،RT-qPCR) PCR ری ایکشن سسٹم میں فلوروسینٹ گروپس کو شامل کرنے کے طریقہ کار سے مراد ہے، فلوروسینٹ سگنلز کے جمع ہونے کا استعمال کرتے ہوئے حقیقی وقت میں PCR کے پورے عمل کی نگرانی کرنا، اور آخر میں ٹیمپلیٹ کا مقداری تجزیہ کرنے کے لیے معیاری وکر کا استعمال کرنا۔عام طور پر استعمال ہونے والے qPCR طریقوں میں SYBR Green I اور TaqMan شامل ہیں۔
4. نیسٹڈ پی سی آر
نیسٹڈ پی سی آر سے مراد پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے دو راؤنڈز کے لیے پی سی آر پرائمر کے دو سیٹوں کا استعمال ہے، اور دوسرے راؤنڈ کا ایمپلیفیکیشن پروڈکٹ ہدف جین کا ٹکڑا ہے۔
اگر پرائمر کے پہلے جوڑے (بیرونی پرائمر) کی مماثلت کسی غیر مخصوص پروڈکٹ کو بڑھاوا دینے کا سبب بنتی ہے، تو اسی غیر مخصوص علاقے کے پرائمر کے دوسرے جوڑے کے ذریعے پہچانے جانے اور بڑھاتے رہنے کا امکان بہت کم ہے، لہذا پرائمر کے دوسرے جوڑے کے ذریعہ پروردن، پی سی آر کی خصوصیت کو بہتر بنایا گیا ہے۔پی سی آر کے دو راؤنڈ کرنے کا ایک فائدہ یہ ہے کہ یہ محدود ابتدائی ڈی این اے سے کافی پروڈکٹ کو بڑھانے میں مدد کرتا ہے۔
5. ٹچ ڈاؤن پی سی آر
ٹچ ڈاؤن پی سی آر پی سی آر سائیکل پیرامیٹرز کو ایڈجسٹ کرکے پی سی آر ردعمل کی خصوصیت کو بہتر بنانے کا ایک طریقہ ہے۔
ٹچ ڈاؤن پی سی آر میں، پہلے چند چکروں کے لیے اینیلنگ کا درجہ حرارت پرائمرز کے زیادہ سے زیادہ اینیلنگ درجہ حرارت (Tm) سے چند ڈگری اوپر سیٹ کیا جاتا ہے۔اینیلنگ کا زیادہ درجہ حرارت غیر مخصوص امپلیفیکیشن کو مؤثر طریقے سے کم کر سکتا ہے، لیکن ایک ہی وقت میں، زیادہ اینیلنگ درجہ حرارت پرائمر اور ہدف کے سلسلے کی علیحدگی کو بڑھا دے گا، جس کے نتیجے میں پی سی آر کی پیداوار کم ہو جائے گی۔لہذا، پہلے چند چکروں میں، نظام میں ہدف والے جین کے مواد کو بڑھانے کے لیے اینیلنگ کا درجہ حرارت عام طور پر 1 ° C فی سائیکل کی کمی کے لیے مقرر کیا جاتا ہے۔جب اینیلنگ درجہ حرارت کو زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت تک کم کر دیا جاتا ہے، تو باقی چکروں کے لیے اینیلنگ کا درجہ حرارت برقرار رکھا جاتا ہے۔
6. براہ راست پی سی آر
ڈائریکٹ پی سی آر سے مراد نیوکلک ایسڈ الگ تھلگ اور صاف کرنے کی ضرورت کے بغیر نمونے سے براہ راست ہدف کے ڈی این اے کو بڑھانا ہے۔
براہ راست پی سی آر کی دو قسمیں ہیں:
براہ راست طریقہ: تھوڑی مقدار میں نمونہ لیں اور اسے پی سی آر کی شناخت کے لیے براہ راست پی سی آر ماسٹر مکس میں شامل کریں۔
کریکنگ کا طریقہ: نمونے کے نمونے لینے کے بعد، اسے لیسیٹ میں شامل کریں، جینوم کو جاری کرنے کے لیے لیس، تھوڑی مقدار میں لیسڈ سپرناٹینٹ لیں اور اسے پی سی آر ماسٹر مکس میں شامل کریں، پی سی آر کی شناخت کریں۔یہ نقطہ نظر تجرباتی کام کے بہاؤ کو آسان بناتا ہے، وقت کو کم کرتا ہے، اور صاف کرنے کے مراحل کے دوران ڈی این اے کے نقصان سے بچاتا ہے۔
7. ایس او ای پی سی آر
اوورلیپ ایکسٹینشن PCR (SOE PCR) کے ذریعے جین کی تقسیم PCR مصنوعات کو اوورلیپنگ چینز بنانے کے لیے تکمیلی سروں کے ساتھ پرائمر کا استعمال کرتی ہے، تاکہ بعد میں ایمپلیفیکیشن ری ایکشن میں، اوورلیپنگ چینز کی توسیع کے ذریعے، A تکنیک کے مختلف ذرائع جس میں ایمپلیفائیڈ ٹکڑے اوورلیپ ہوتے ہیں۔ اور ایک ساتھ جوڑ دیا.اس ٹیکنالوجی میں فی الحال استعمال کی دو اہم سمتیں ہیں: فیوژن جینز کی تعمیر؛جین سائٹ پر مبنی اتپریورتن۔
8. آئی پی سی آر
الٹا پی سی آر (آئی پی سی آر) دو پرائمر کے علاوہ ڈی این اے کے ٹکڑوں کو بڑھاوا دینے کے لیے معکوس تکمیلی پرائمر کا استعمال کرتا ہے، اور ایک معلوم DNA ٹکڑے کے دونوں طرف نامعلوم ترتیب کو بڑھا دیتا ہے۔
آئی پی سی آر کو اصل میں ملحقہ نامعلوم علاقوں کی ترتیب کا تعین کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا تھا، اور زیادہ تر جین پروموٹر کی ترتیب کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔آنکوجینک کروموسومل دوبارہ ترتیب، جیسے جین فیوژن، ٹرانسلوکیشن اور ٹرانسپوزیشن؛اور وائرل جین انٹیگریشن، اب بھی عام طور پر استعمال کیا جاتا ہے سائٹ سے ہدایت شدہ mutagenesis کے لیے، مطلوبہ اتپریورتن کے ساتھ ایک پلازمیڈ کاپی کریں۔
9. ڈی پی سی آر
ڈیجیٹل پی سی آر (ڈی پی سی آر) نیوکلک ایسڈ مالیکیولز کی مطلق مقدار کے لیے ایک تکنیک ہے۔
نیوکلک ایسڈ مالیکیولز کی مقدار درست کرنے کے لیے فی الحال تین طریقے ہیں۔فوٹومیٹری نیوکلک ایسڈ مالیکیولز کے جذب پر مبنی ہے۔ریئل ٹائم فلوروسینٹ مقداری پی سی آر (ریئل ٹائم پی سی آر) Ct قدر پر مبنی ہے، اور Ct قدر سے مراد وہ سائیکل نمبر ہے جو فلوروسینس قدر کے مطابق ہے جس کا پتہ لگایا جا سکتا ہے۔ڈیجیٹل پی سی آر ایک واحد مالیکیول پی سی آر طریقہ پر مبنی جدید ترین مقداری ٹیکنالوجی ہے جو نیوکلک ایسڈ کی مقدار کو شمار کرنے کے لیے ایک مطلق مقداری طریقہ ہے۔
پوسٹ ٹائم: جون 13-2023