الٹرا فلٹریشن سینٹری فیوج ٹیوب کا استعمال اور احتیاطی تدابیر
1) مناسب الٹرا فلٹریشن ٹیوب کا انتخاب کریں۔نوٹ کریں کہ UF جھلی مختلف کیمیکلز کے لیے اپنی رواداری کی سطح میں مختلف ہوتی ہیں۔عام طور پر، 10 kDa مالیکیولر ویٹ کٹ آف کے ساتھ الٹرا فلٹریشن ٹیوبوں کا انتخاب مالیکیولر ویٹ کٹ آف کے ساتھ کیا جا سکتا ہے جو کہ دلچسپی کے پروٹین کے مالیکیولر وزن کے 1/3 سے زیادہ نہیں ہونا چاہیے، جیسے 35 kDa۔اگر دلچسپی کے پروٹین کا مالیکیولر وزن تقریباً 10 kd ہے، تو 3 KD کے مالیکیولر ویٹ کٹ آف کے ساتھ الٹرا فلٹریشن ٹیوب استعمال کی جا سکتی ہے۔
(2) الٹرا فلٹریشن، تازہ خریدی گئی، خشک ہے، استعمال کرنے سے پہلے الٹرا پیور پانی شامل کیا جاتا ہے اور پانی مکمل طور پر جھلی سے گزر جاتا ہے، برف کے غسل یا ریفریجریٹر کو چند منٹوں کے لیے پہلے سے ٹھنڈا کیا جاتا ہے۔پھر پانی ڈالا جاتا ہے، یعنی پروٹین مائع، اور کتنا شامل کیا جاتا ہے، جو بھی ٹیوب کے اوپر سفید لائن سے زیادہ نہ ہو۔آپریشن ہلکا ہے، اور پروٹین کے محلول کو شامل کرنے سے پہلے الٹرا فلٹریشن ٹیوب کو برف پر پہلے سے ٹھنڈا کرنے کی ضرورت ہے۔
3) کشش ثقل کے ماس اور مرکز دونوں کو توازن تک پہنچنا تھا۔نوٹ کریں کہ گردش کی رفتار اور سرعت بہت تیز نہیں ہے، بصورت دیگر الٹرا فلٹریشن جھلی کو براہ راست نقصان پہنچاتی ہے۔سینٹرفیوگل الٹرا فلٹریشن شروع کیا گیا تھا (سینٹری فیوج کو 4 ڈگری پر ٹھنڈا کیا گیا تھا)۔مختلف سینٹری فیوجز کے RPM کو جی میں تبدیل کرنے کے بعد، یہ مختلف تھا۔سنٹری فیوج کی سرعت کو کم سے کم ایڈجسٹ کیا گیا تھا، جس سے جھلی پر دباؤ کم ہوتا تھا۔نوٹ کریں، سینٹری فیوج کو اپنی منزل کی رفتار تک پہنچنے کے بعد سینٹری فیوج کو چھوڑنا یقینی بنائیں، یا اگر آپ کو کوئی مسئلہ ہے، تو آپ اسے پہلی بار سنبھال نہیں سکتے۔تکلی کی طرف جھلی کی واقفیت کو ہدایات کے مطابق ایڈجسٹ کیا گیا تھا (کونی سنٹرفیوج کیس جھلی سے محور تک کھڑا ہے)۔عملی استعمال میں، عام گردش کی رفتار ہدایات میں اس سے کم ہے، تاکہ سینٹرفیوج ٹیوب کی زندگی کو بڑھایا جا سکے۔
3) کشش ثقل کے ماس اور مرکز دونوں کو توازن تک پہنچنا تھا۔نوٹ کریں کہ گردش کی رفتار اور سرعت بہت تیز نہیں ہے، بصورت دیگر الٹرا فلٹریشن جھلی کو براہ راست نقصان پہنچاتی ہے۔سینٹرفیوگل الٹرا فلٹریشن شروع کیا گیا تھا (سینٹری فیوج کو 4 ڈگری پر ٹھنڈا کیا گیا تھا)۔مختلف سینٹری فیوجز کے RPM کو جی میں تبدیل کرنے کے بعد، یہ مختلف تھا۔سنٹری فیوج کی سرعت کو کم سے کم ایڈجسٹ کیا گیا تھا، جس سے جھلی پر دباؤ کم ہوتا تھا۔نوٹ کریں، سینٹری فیوج کو اپنی منزل کی رفتار تک پہنچنے کے بعد سینٹری فیوج کو چھوڑنا یقینی بنائیں، یا اگر آپ کو کوئی مسئلہ ہے، تو آپ اسے پہلی بار سنبھال نہیں سکتے۔تکلی کی طرف جھلی کی واقفیت کو ہدایات کے مطابق ایڈجسٹ کیا گیا تھا (کونی سنٹرفیوج کیس جھلی سے محور تک کھڑا ہے)۔عملی استعمال میں، عام گردش کی رفتار ہدایات میں اس سے کم ہے، تاکہ سینٹرفیوج ٹیوب کی زندگی کو بڑھایا جا سکے۔
(4) جب بقیہ 1ml پر مرتکز ہو جائیں تو 50ul بفر محلول لیں، 10ul بہاؤ شامل کریں اور دیکھیں کہ آیا کوئی نیلا رنگ ہے، اس فیصلے کے طور پر کہ آیا الٹرا فلٹریشن ٹیوب میں پروٹین نہیں ہے۔اگر ٹیوب لیک ہو تو اوپری تہہ کو دوبارہ ڈالیں اور الٹرا فلٹریشن شروع کرنے کے لیے ایک نئی ٹیوب میں فلو تھرو کریں۔اس بات کا درست تعین کرنے کے لیے کہ آیا ٹیوبیں چھوٹ گئیں، فلو تھرو سے پہلے BSA کے 5mgml کے ساتھ 10 منٹ کے لیے سینٹری فیوج، پروٹین گلو یا بریڈ فورڈ کروڈ پرکھ پر چلائیں، اور باقی ماندہ پروٹین محلول (جو برف پر چلتی ہے اور پروٹین کو گرم ہونے سے روکتی ہے) کو شامل کرکے جاری رکھیں۔ تمام ارتکاز کو شامل کیا گیا ہے۔سینٹرفیوگریشن کے دوران احتیاط برتیں اگر پروٹین کی بارش ہوتی ہے، جس سے ٹیوب بند ہوجاتی ہے۔اگر بارش ہوتی ہے، تو اس بات کا تعین کریں کہ آیا بارش کی خاص وجہ پروٹین کی زیادتی ہے یا نامناسب بفر؛سابقہ کو بیک وقت متعدد الٹرا فلٹریشن ٹیوبوں کے الٹرا فلٹریشن کے ذریعے حل کیا جا سکتا ہے، ارتکاز کو کم کر کے، اور بعد والے کو مختلف بفر سلوشنز کے تبادلے کے ذریعے حل کیا جا سکتا ہے جب تک کہ پروٹین کی بارش نہ ہو۔
(4) جب بقیہ 1ml پر مرتکز ہو جائیں تو 50ul بفر محلول لیں، 10ul بہاؤ شامل کریں اور دیکھیں کہ آیا کوئی نیلا رنگ ہے، اس فیصلے کے طور پر کہ آیا الٹرا فلٹریشن ٹیوب میں پروٹین نہیں ہے۔اگر ٹیوب لیک ہو تو اوپری تہہ کو دوبارہ ڈالیں اور الٹرا فلٹریشن شروع کرنے کے لیے ایک نئی ٹیوب میں فلو تھرو کریں۔اس بات کا درست تعین کرنے کے لیے کہ آیا ٹیوبیں چھوٹ گئیں، فلو تھرو سے پہلے BSA کے 5mgml کے ساتھ 10 منٹ کے لیے سینٹری فیوج، پروٹین گلو یا بریڈ فورڈ کروڈ پرکھ پر چلائیں، اور باقی ماندہ پروٹین محلول (جو برف پر چلتی ہے اور پروٹین کو گرم ہونے سے روکتی ہے) کو شامل کرکے جاری رکھیں۔ تمام ارتکاز کو شامل کیا گیا ہے۔سینٹرفیوگریشن کے دوران احتیاط برتیں اگر پروٹین کی بارش ہوتی ہے، جس سے ٹیوب بند ہوجاتی ہے۔اگر بارش ہوتی ہے، تو اس بات کا تعین کریں کہ آیا بارش کی خاص وجہ پروٹین کی زیادتی ہے یا نامناسب بفر؛سابقہ کو بیک وقت متعدد الٹرا فلٹریشن ٹیوبوں کے الٹرا فلٹریشن کے ذریعے حل کیا جا سکتا ہے، ارتکاز کو کم کر کے، اور بعد والے کو مختلف بفر سلوشنز کے تبادلے کے ذریعے حل کیا جا سکتا ہے جب تک کہ پروٹین کی بارش نہ ہو۔
(5) پروٹین کو مرتکز کرنے کے لیے پہلے چند مراحل کا استعمال کیا جاتا ہے، اور اگر بفر کو تبدیل کرنا ہے، تو آہستہ سے نئے بفر (0.22um الٹرا فلٹریشن جھلی کے ذریعے الٹرا فلٹریشن) کل پروٹین کے تقریباً 1 ملی لیٹر میں شامل کریں، اور تین کے لیے تقریباً 1 ملی لیٹر پر دوبارہ توجہ دیں۔ لگاتار بار، مطلوبہ پروٹین کے ارتکاز پر منحصر حتمی مرتکز حتمی حجم کے ساتھ، عام طور پر 500ul سے زیادہ نہیں، بلکہ 200ul کے اندر بھی۔تین مواقع پر 1000 × یا اس سے زیادہ حاصل کریں، بنیادی طور پر اتنی ہی بفر تبدیلی، جیسا کہ ہر بار کم از کم 10 × یا اس سے زیادہ حجم کی افزودگی کے حساب سے۔
(5) پروٹین کو مرتکز کرنے کے لیے پہلے چند مراحل کا استعمال کیا جاتا ہے، اور اگر بفر کو تبدیل کرنا ہے، تو آہستہ سے نئے بفر (0.22um الٹرا فلٹریشن جھلی کے ذریعے الٹرا فلٹریشن) کل پروٹین کے تقریباً 1 ملی لیٹر میں شامل کریں، اور تین کے لیے تقریباً 1 ملی لیٹر پر دوبارہ توجہ دیں۔ لگاتار بار، مطلوبہ پروٹین کے ارتکاز پر منحصر حتمی مرتکز حتمی حجم کے ساتھ، عام طور پر 500ul سے زیادہ نہیں، بلکہ 200ul کے اندر بھی۔تین مواقع پر 1000 × یا اس سے زیادہ حاصل کریں، بنیادی طور پر اتنی ہی بفر تبدیلی، جیسا کہ ہر بار کم از کم 10 × یا اس سے زیادہ حجم کی افزودگی کے حساب سے۔
پوسٹ ٹائم: نومبر-09-2022